蔡司掃描電鏡植物葉片樣品處理方法

目前☁│，應用蔡司掃描電鏡觀察植物的精細結構特徵已成為植物學研究的重要手段之一☁│，但這些植物樣品中普遍含有水分₪₪。對於含水量較低的植物樣品☁│，通常只需透過表面清潔·◕╃▩、樣品貼在樣品臺上等簡單過程即可進行觀察₪₪。但是☁│，如果直接觀察含水量高的植物樣品☁│，在蔡司掃描電鏡的真空管中會造成很多不良後果:

①樣品經電子束轟擊後☁│，蒸發的水蒸氣遇到高能電子流☁│，發生電離放電☁│，產生較大波動☁│，使影象模糊☁│，起霧☁│，或根本不成像；

 

②大部分樣品在高真空下容易發生形態損傷☁│，使研究特徵收縮變形；

 

③物鏡·◕╃▩、鏡頭·◕╃▩、光圈汙染；④燈絲遇水蒸氣氧化·◕╃▩、變質☁│，甚至熔斷₪₪。

 

雖然近年來出現了可以觀察含水樣品的蔡司掃描電子顯微鏡☁│，但上述觀察方法的解析度較低₪₪。因此☁│，目前無水樣品的掃描電鏡被廣泛應用₪₪。因此☁│，要獲得良好的蔡司掃描電鏡觀察效果☁│，制樣方法是關鍵☁│，一般需要固定·◕╃▩、脫水·◕╃▩、更換·◕╃▩、乾燥₪₪。本文對掃描電鏡制樣過程中植物葉片的固定·◕╃▩、脫水·◕╃▩、置換和乾燥的不同研究方法進行了總結和比較☁│，以期為相關研究提供參考₪₪。

固定的；不變的目前有戊二醛·◕╃▩、FAA·◕╃▩、鋨酸·◕╃▩、卡諾固定劑·◕╃▩、甲醇等₪₪。廣泛用於固定植物葉片₪₪。對於一些容易固定或不易變形的材料☁│，為了降低實驗成本☁│，可以使用戊二醛進行固定₪₪。固定溶液濃度的選擇很大程度上取決於葉子樣品的含水量和嫩度₪₪。用過低或過高濃度的戊二醛溶液(4℃固定4 h)處理嫩葉和含水量高的葉片時☁│，大部分葉片失水嚴重☁│，導致表面形態觀察不清₪₪。選擇合適的濃度進行固定處理☁│，觀察效果比較好☁│，葉細胞形態比較飽滿₪₪。

脫水

對於植物葉片樣品的脫水置換處理☁│，常用的方法是在每個濃度下用梯度乙醇溶液脫水15 min☁│，然後用叔丁醇置換100%乙醇₪₪。室溫下☁│，先用乙醇-叔丁醇溶液20 min☁│，再用100%叔丁醇30min☁│，再用100%叔丁醇反覆置換一次₪₪。置換過程中省略了乙醇-叔丁醇溶液的處理☁│，直接用100%叔丁醇置換三次即可獲得理想的結果₪₪。此外☁│，在脫水前☁│，研究人員可以使用所選固定劑對應的緩衝溶液進行反覆清洗☁│，以去除固定劑☁│，防止戊二醛與鋨酸反應或防止戊二醛與脫水劑(乙醇·◕╃▩、叔丁醇)反應☁│，導致沉澱☁│，影響固定化效果₪₪。

乾燥的

樣品的乾燥方法有多種☁│，如自然乾燥·◕╃▩、烘箱乾燥·◕╃▩、臨界點乾燥·◕╃▩、叔丁醇真空乾燥和冷凍乾燥₪₪。自然乾燥法一般可用於含水量低·◕╃▩、細胞壁厚·◕╃▩、蠟質層厚的植物葉片或老葉☁│，操作簡便₪₪。乾燥法適用於堅硬耐熱的植物葉片☁│，如被子植物葉片₪₪。臨界點乾燥法和叔丁醇真空乾燥法幾乎適用於各種植物樣品☁│，但考慮到操作的複雜性☁│，當可以採用更簡單的乾燥方法時☁│，一般不選用₪₪。冷凍乾燥法能反映樣品真實的微形態特徵☁│，但冷凍乾燥過程中冷凍和脫水脅迫會對植物葉片造成損傷₪₪。需要掌握最佳的凍幹溫度和時間☁│，適合水分較多的幼葉₪₪。

 

本文將水稻·◕╃▩、小麥·◕╃▩、花生的葉片用4%戊二醛溶液固定2小時☁│，再用30~100%梯度乙醇脫水(每個濃度15分鐘)☁│，再用100%叔丁醇反覆置換3次(每次30分鐘)☁│，最後自然風乾₪₪。葉子曬乾後☁│，樣品噴金☁│，然後在掃描電鏡下觀察₪₪。

圖3顯示了蔡司臺式掃描電子顯微鏡下的葉片形態₪₪。圖(a)和(b)顯示了水稻葉的表面形態☁│，圖(c)和(d)顯示了小麥葉的表面形態☁│，圖(e)和(f)顯示了花生葉的表面形態₪₪。在蔡司掃描電鏡下☁│，處理後的葉片可獲得良好的微形態結構☁│，細胞形態良好☁│，邊界清晰☁│，氣孔形態正常☁│，但仍有輕微收縮現象₪₪。目前無論用什麼方法對掃描電鏡樣品進行預處理☁│，都不能完全避免細胞皺縮·◕╃▩、膨脹等變形☁│，也沒有一種掃描電鏡處理和觀察方法可以適用於所有型別的植物葉片☁│，只能達到一種相對理想的狀態₪₪。為了取得更好的效果☁│，我們需要在未來不斷探索₪₪。